PCR-RFLP 反应

PCR反应体系:在 200ul离心管中进行，反应总体积为30ul， 反应体系包括2XPCR预混液15ul,鉴别引物(30umol/L)各0.5ul,模板 l ul，无菌超纯水13ul。将离心管置PCR仪，PCR反应参数:95°C 预变性4分钟，循环反应30次(95°C 30秒，55〜58°C ，72°C 3 0 秒 )，7 2 °C延 伸 5 分 钟 。 取 P C R 反 应 液 ，置 500ul离心管中，进行酶切反应，反应总体积为20ul，反应体系包括10X酶切缓冲液2ul,PCR反应液6ul，Sma I(10U/M1) 0.5ul，无菌超纯水11.5ul,酶切反应在30°C水浴反应2小 时。另取无菌超纯水，同法上述PCR-RFLP反应操作，作为空白对照。

电泳检测照琼脂糖凝胶电泳法(中国药典2020年版通则0541)

胶浓度为 1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed;供试品与对照药材 酶切反应溶液的上样量分别为8ul, DNA分子量标记上样量为 l ul (0.5ug/ul)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材 凝胶电泳图谱相应的位置上，在100〜250bp应有两条DNA 条带，空白对照无条带。