无乳链球菌（Strep. agalactiae）和金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）被认为是奶牛乳腺炎的重要传染性病原，然而这两种病原最近都从奶牛乳房外和环境中分离出来，表明除乳房以外的其他部位可能有这两种病原传播并导致乳房内感染。可以使用检测乳房外部位病原的诊断方法，但诊断方法仍需要验证。本研究的目的是评价丹麦 Mastit4 qPCR检测试剂盒和细菌培养 (BC) 方法在来自牛奶和乳头皮肤样本中检测无乳链球菌（Strep. agalactiae）和金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）中的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)比较。从具有自动挤奶系统的8个无乳链球菌阳性的丹麦奶牛场中随机选择了 30-40 头体细胞计数高的奶牛，从右后方 (n = 287) 收集乳头皮肤样品和无菌牛奶样品用于细菌培养和 qPCR 检测分析，灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)采用贝叶斯统计分析来评价。对于牛奶样品，无乳链球菌 qPCR检测的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)分别为 0.97 和 0.99，而细菌培养的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)分别为 0.41 和 1.00。 金黄色葡萄球菌的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)分别为0.95 和 0.99，而传统细菌培养的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)分别为 0.54 和 0.77。对于乳头皮肤样本，无乳链球菌 qPCR检测的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)分别为 0.97 和 0.96，而传统细菌培养的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)分别为 0.33 和 1.00。金黄色葡萄球菌的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)分别为0.94 和 0.98，而传统细菌培养的灵敏度(Se) 和特异性 (Sp)分别为 0.44 和 0.74。总之，用于检测无乳链球菌（Strep. agalactiae）和金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）qPCR试剂盒灵敏度(Se)比细菌培养方法要高，这表明 qPCR方法是一种有价值的方法，可用于检测牛奶样品中的这两种病原。细菌培养法与 qPCR方法相比，细菌培养法在检测乳头皮肤上的无乳链球菌（Strep. agalactiae）和金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）方面的性能较差，这表明在将这两种方法作为乳头皮肤定植菌的常规检测方法时，应考虑两种方法的目标条件的差异。细菌培养发的低灵敏度可能会妨碍使用细菌培养进行皮肤检测，而 qPCR方法更适合这项检测。