病原微生物的检测是感染类疾病的诊断治疗中*的重要环节。

      传统的病原微生物检测方法分为培养和非培养两类，临床*的金标准是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高，并且不是每种病原体都可以培养。相比之下，不依赖培养的镜检、抗体抗原免疫等方法，在采样当天即可报告结果。这些方法的时效性强，但在准确性上存在明显劣势。

      近年来，基于核酸检测的分子诊断技术发展迅速。基于PCR的方法直接从样本中识别微生物可以加速鉴定，但这些测试仅包括少量病原体，在选择测试之前需要进行推定诊断，仍然不能满足的临床需要。

然而，大量的重症感染病例由于不能得到及时的诊断和治疗而延误病情，造成不可挽回的严重后果。如何才能实现快速，高效，精准，无创，广谱定性的病原检测已成为临床医学追求的目标。

      cfDNA检测技术让这一希望得以实现：这种非侵入性诊断技术目前在在胎儿异常诊断、移植器官排异检测及癌症的表征及检测中已得到大量应用，而在病原感染检测中，cfDNA检测技术可以实现血浆中不同位置感染的病原体DNA的片段检测，实现无创检测多种感染的可能。

      脓毒症，一种因感染导致组织和器官损伤，进而造成的全身性炎症反应。每年有近3000万人会感染此类疾病，其中超过1800万为严重病例，800万人会因此丧生。早期的发现和适当的治疗在脓毒症预防和控制方面意义重大。

   2019年，著名学术期刊《Nature microbiology》报道了一例利用cfDNA技术检测脓毒症病原的实例，工作流程如下图：

     基于此技术，病原微生物的临床可报告范围（CRR）有了极大拓展，可包括（1）DNA病毒，可培养细菌，其他条件苛刻和不可培养的细菌，分枝杆菌，文献中的真核病原体；（2）在已发表的病例报告中引用的病原体数据库；（3）从临床分离测序获得的参考基因组以及已报道的致病性病原。

     这其中，快速精准以及低微核酸起始量（10pg-100ng）的测序文库构建，得益于Tecan*的Ovation Ultralow Library System V2 文库构建技术，该技术广泛适用于各种类型的核酸样本建库，尤其在面对cfDNA检测的超低起始量时表现良好，并能在3小时内完成简单，自动化的建库过程，并能应对各种GC含量的高保真扩增。技术路线如下：

Ovation Ultralow Library System V2可应用于各种类型的测序研究，包括：全基因组测序、外显子测序、ChIP-seq、微生物组研究，液态活检，石蜡包埋样本（FFPE）等。建库过程中不会产生接头二聚体（见下图，与竞品的比较）。

效果稳定，不受核酸起始量影响：

在GC含量的样本中也能有稳定出色的表现：

在《Nature microbiology》的脓毒症cfDNA病原检测研究中，Ovation Ultralow Library System V2大放异彩。研究中利用350名败血症患者，166份未发现明确脓毒症的样本开展cfDNA的提取，运用二代测序检测技术，鉴别并定量血液中1250种与临床相关的细菌、DNA病毒、真菌和真核寄生虫，可利用血液中游离微生物DNA（cfDNA），准确、快速地诊断多种感染。

研究中的cfDNA病原微生物检测，可以实现高度敏感（灵敏度LoD &小检测量 LoQ）的病原微生物检测,广谱病原检测可报告范围使cfDNA病原检测技术具有更广泛的敏感性：在不用含量血浆DNA检测中均有出色表现，结合临床验证，125次模拟中有121次正确检测，灵敏度达97%：阳性预a-c测值（Ppv）达99%，与预测的95%高度一致（图a-c）；

      该技术可实现病原的精准检测，在实验模型中进行检测精准度研究发现，快速检验测试中的重复测量，个体微生物的平均变异系数为21.1%（±13.6%），与实验室内的检测精密度相当。

      由于个体间cfDNA中病原成分的差异，在使用临床样本时难以准确区分cfDNA中低水平存在的环境污染DNA。所以研究利用重复测量评估了这种方法检测的分析特异性（下图）。在被测试的50件复制品中，意外的微生物cfDNA仅在一次复制中检出，总特异性为98%；以不同比例混入混入菌株检测，检测值与预期也保有良好一致性，同时证实了密切相关物种共感染造成的干扰极低。

     为了评价血浆来源的微生物cfdna作为广泛感染病原体的生物标志物的有效性，研究亦将微生物cfDNA测序结果与病原体鉴定结果进行了比较（下图）。与原血培养相比，cfDNA技术敏感度可达93.7%，同时cfDNA技术提供了物种级鉴定的灵敏度和速度。

       血液游离微生物DNA测序，有望作为非侵入性检测方法用于感染疾病检测。而快速高效高灵敏精准的建库技术则是临床病原体检测诊断的核心。Ovation Ultralow Library System V2技术，完美将快速建库，低核酸起始量背景，高精准测量要求整合，满足了多种研究和样本类型的建库要求，为科学研究及临床医学应用提供了强有力的技术支撑。

参考文献：

Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nature microbiology,2019.