加热块均匀性分析

作者：文/ Andrew Birnie 本文作者供职于PCRmax公司。 文章来源：PROCESS制药网 《制药业》 发布时间：2015-12-10

图 1 qPCR空心银块示意图 (Eco 48 PCRmax)。该创新硬件具有稳健的热性能，能够加速 qPCR 操作规程

新一代测序技术(NGS)凭借的数据吞吐率、可扩展性和速度使得研究人员能够以的水平研究生物系统。现如今，基因组研究问题越来越复杂，除了传统的DNA测序技术外，迫切需要更深入的信息支持。新一代测序技术地弥补了这一空缺，成为解决转译研究领域诸多问题的日常研究工具，例如临床诊断、农业基因组以及法医学。

但是这同时也是挑战。NGS 运行每失败一次都将给实验室带来巨大的损失，事实上有时候造成的损失可以高达3000美元。

为了确保测序技术的成本效益并精简流程提高准确性，实验室需要确保不会让缺乏性和均匀性的qPCR技术对运行造成破坏。这可能与所使用的仪器有很大关系。每一PCR系统中的多种因素，从温度控制到光渗透，都会对每次运行的可靠性产生影响。通过实现*均匀性，制造商能够确保每次运行*可靠且准确。

为了确保可靠性和准确性，商用仪器中也逐步采用创新型新技术。本文将介绍这些仪器(例如Eco 48实时PCR系统，PCRmax)如何在加热块中实现*的均匀性，以及其可靠性等级在工作实验室范围内产生的影响。

图 2显示所有 48 个孔板数据的基线校正扩增图。数据分析显示平均 Cq 为 13.31，标准偏差为 ±0.061，而整个孔板的 %CV 仅为 0.46%，表示精度非常高

提高NGS技术性能

的DNA扩增是基因组研究的基本追求。同时，高吞吐率 NGS技术的研发也通常被视为过去30年生物科学领域革命性的创新之一。如今这一强度的技术已经取代了以桑格测序为行业标准的传统PCR技术，例如毛细管和凝胶技术。

NGS技术能够使研究人员同时处理百万条多量级的平行 DNA 序列，速度比传统测序技术更快。但是NGS的成本依然很高;一套商用NGS系统的价格大约在15万~100万美元之间，同时驱动这些流程的成本也非常高。因此，方法研制的关键便在于优化每次运行的条件，将故障风险降至zui低，实现zui大化。目标库定量已被视为能够利用成本有效性技术从而简化NGS工作流的领域。

NGS流程需要制备目标库，并且在该库中靶分子片段将与衔接子相融合，随后通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增和测序。zui终库中目的DNA片段的大小将成为构建NGS库的关键参数。如果 NGS平台上加载的模板过少，运行的效率将非常低。如果平台上加载的模板过多，那么不仅会导致效率低下，还会增加*失效的可能性。因此稳健且可靠的库定量非常关键。

图 3显示孔板中 48 个孔数据的标称熔点曲线。100bp PCR 产物在 75~95 ℃ 范围内熔化，Eco 48以0.1 ℃的温度变化测量荧光性，IV 级 SNP 的检测精度需要超过 99%

定量PCR(qPCR)是NGS库定量可选的技术之一。但是，并不是所有的PCR系统均能够带来足够的热均匀性，满足NGS系统安全加载所需的高重复性和度。此外，冗长的qPCR操作规程会严重影响整个NGS运行的效率。由于一次失败运行所损失的成本超过了高性能qPCR仪器的价格，因此采用稳健的定量qPCR技术被视为实现一致NGS的zui简单且成本效益的方式之一。

图 4(A和 B)：孔板48个孔的Cq和Tm数据概览。所有48个样本的记录zui大变化为0.24个周期，整个孔板的Tmzui大范围为 0.2 ℃(84.3~84.5 ℃)

选择正确的 PCR 技术

qPCR可以监控退火流程期间荧光引物的排放物，从而可以监控链扩增。为了在适当的反应阶段进行定量分析，将实时捕获荧光信号。这可以克服传统、半定量端点检测产生的相关不性，包括样本之间PCR效率的不明变化以及回推起始量时产生的误差。

温度控制是qPCR技术的核心所在;其将决定引物能否有效结合以及聚合酶能否起到*效果。为了实现高准确度，实时 PCR热系统必须确保整个加热快的温度均匀性，确保能够以相同速率的反应处理所有的样本。但是，标准qPCR系统在50~60 ℃温度范围内的热准确性只有大约 ±0.5 ℃。通常这不足以地定义聚类密度，并且如果qPCR平台低于或超过实际库浓度时，NGS 运行可能会面临故障风险。对于 qPCR实验，严格的MIQE(定量实时PCR试验发布的zui低限度的信息)指南强调了精度的重要性，需要采用灵敏度更高的qPCR技术。

传统qPCR系统采用珀耳帖热保温块来驱动热循环。加热这些实心块的整个表面数据能量密集型流程。在平衡至稳定时期之前，大多数基于珀尔贴的系统会超过所需的反应温度。加热块范围内所有孔达到该点所需的时间将延长运行时间。更重要的是，这种加热方法会导致较高的热不均匀性(TNU)，数值为±0.5 ℃，并导致较差的升温斜率。不准确和效率低导致传统的实心块qPCR 无法适用于高性能应用。

qPCR加热技术的发展克服了上述难题。现代系统利用*均匀的空心银块，其中将流经导电流体。使用单一的珀尔贴设备来加热和冷却流体，随后流体通过反向搅拌器将在所有的样本孔中均匀循环。这可以确保稳健的热性能，使得95 ℃条件下的 TNU值低于±0.1 ℃，从而可以缩短运行时间。使用该系统的标 40循环PCR操作规程大约需要40 min的时间才能完成，而优化后的流程只需要15 min的时间便可完成。

荧光监测技术取得的发展改善了qPCR技术的性能。高性能光学系统使得能够在一次反应中实时监测多达四种目标物，并且先进的探测器阵列能够监控源自所有孔的荧光，允许系统记录每个孔、过滤器和周期，不会遗漏任一数据点。zui终，利用稳定的发光二极管(LED)帮助生成准确的数据，可以延长仪器使用寿命，降低折旧成本。

下列案例研究说明了加热块热均匀性的改善是如何带来高性能NGS应用所需的灵敏度、精度和整体效率。

案例研究：提高 qPCR 精度

48个复制样本通过PCRmax Eco48进行高分辨率熔解(HRM) 操作。HRM 确保能够对遗传变异进行准确地分析，例如量化单核苷酸多态性(SNP)，就精度而言是需热量zui大的操作规程之一。

48个样本孔中的每一个都注满了 1×10 8个起始模板的副本，zui终体积为10 ul。孔板进行了密封，并在12 000 rpm 条件下进行离心分离1 min，未优化40循环 PCR 操作规程的总体完成时间为 43min。使用源自 Promega 的 GoTaq® QPCR GoTaq® QPCR Master Mix (2x)(产品代码 A6001)对模板进行扩增处理，用于40次循环。在60 ℃操作结束时将收集荧光光谱数据。使用生态研究软件分析结果，以确定定量循环 (Cq)、荧光检测点以及48个复制品中每一个的解链温度 (Tm) 值。

图 2 显示了所有 48 个孔的基线校正扩增图谱。该图清晰展示了整个孔板的扩增精度。数据分析显示平均 Cq 为 13.31，标准偏差为 ±0.061。这意味着整个孔板的变异系数 (%CV) 仅为 0.46%，表示精度非常高。 PCR产物扩增后运行熔化阶段，借此来确定 Tm，而Tm是确定加热块均匀性zui有效的衡量标准之一。扩增产物在75~95℃范围内熔化，Eco 48以0.1℃的温度变化为变量来测量荧光性， IV级 SNP的检测精度需要超过 99%。图 3 显示了标称熔点曲线。所有 48个孔板的平均 Tm 为 84.45℃，标准偏差为 ±0.058，相当于整个孔板的%CV 仅为0.07%。这说明加热块的温度均匀性非常*。图4A和4B概述了该实验的结果。

推动基因组学未来发展

采用热准确性的系统能够提高所有PCR应用的分析生产率。但是，人们越来越认为更大程度的温度控制会给用户在NGS 流程期间造成更大的成本，这就使得高性能qPCR成为例行测序的关键特点。采用创新加热块技术的qPCR仪器，例如PCRmax Eco 48，可以在40  min内完成热均匀性和快速循环，每次温度变化后，整个加热块立即会发生±0.1℃ 的均匀性变化。